摘要：【目的】 为预防水源性疾病暴发和保障水质安全,建立快速、准确的检测水中活性病原菌的方法至关重要。 鉴于生活饮用水细菌含量较低,建立一种适用于大体积饮用水中铜绿假单胞菌检测的富集浓缩及叠氮溴化丙锭-定量聚合酶链式反应(PMA-qPCR)方法。 【方法】 通过调整涡旋振荡时长,计算加标回收率,优化富集浓缩方法;采用L₁₆(43)正交试验筛选能够有效去除铜绿假单胞菌死菌脱氧核糖核酸的PMA 处理条件的最佳组合,并进行验证。 【结果】 通过膜过滤法将10 L 饮用水中的铜绿假单胞菌富集至膜上后,采用涡旋振荡(转速为3 000 r/min,振荡时间为15 min,重复2 次)及离心(8 000 g,10 min)的方式将膜上的细菌洗脱至1 mL 磷酸盐缓冲液(PBS)中。 该方法在50 min 内完成且回收率可达80.95%±7.43%。PMA-qPCR 法的最优PMA 处理条件:PMA 浓度为30 μmol/L、黑暗中孵育时间为20 min、光暴露时间为20 min。 该方法与平板计数法的检测结果一致,可有效抑制死菌DNA 的扩增。 活菌数与PMA-qPCR 扩增循环数为1×102～1×106CFU/mL 时呈现良好的线性关系(R2=0.99),建立的标准曲线方程(y=-3.541x+44.11)可定量检测活菌数量。 PMA-qPCR 法定量限为1×102 CFU/mL,且结合富集的方式,灵敏度可被提高1×104 倍。 【结论】 该研究建立的检测方法适用于10 L 大体积饮用水中铜绿假单胞菌活菌的定量分析,为后续深入研究提供了有效的技术手段。

关键词：铜绿假单胞菌，叠氮溴化丙锭(PMA)，荧光定量聚合酶链式反应(PCR)，活菌计数，饮用水

基金资助：国家重点研发计划(2022YFC3204702)

下载

查看